Cloramfenicolo 121

+

Il cloramfenicolo-Sensitive Strain Escherichia coli Esprimendo il cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) Gene Riepilogo Un Escherichia coli ceppo (ceppo CM2555) che porta il acetiltransferasi cloramfenicolo (cat) gene è risultato essere sensibili al cloramfenicolo. Abbiamo dimostrato che il gene gatto è efficacemente espresso in ceppo CM2555. I nostri risultati suggeriscono che i livelli di coenzima A è diminuito nel gatto esprimente cellule CM2555 in presenza di cloramfenicolo può causare il batterio ad essere sensibile a questo antibiotico. Uno dei meccanismi di resistenza batterica meglio caratterizzata è la sintesi di cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) (3. 9. 12. 23). La produzione di questo enzima, codificato dal gene cat, è il mezzo più comune per cui i batteri diventano resistenti al cloramfenicolo (13. 22), un piccolo antibiotico batteriostatico che interagisce con un centro peptidil transferasi (16). CAT catalizza il trasferimento della frazione acetil da acetil coenzima A (acetil-CoA) ad una molecola cloramfenicolo (8, 12). Così modificato, cloramfenicolo non si lega ai ribosomi e ricavato sintesi proteica (12). Recentemente, un coli ceppo Escherichia, ceppo CM2555, è stato identificato in cui non sono state selezionate trasformanti quando cloramfenicolo è stato usato come agente selettivo durante i tentativi di introdurre plasmidi che trasportano il gene cat (21). cat - bearing ceppo CM2555 è risultato essere sensibili al cloramfenicolo (21). Lo scopo del lavoro descritto qui era indagare il meccanismo di questa phenomemon. I ceppi batterici e plasmidi utilizzati in questo lavoro sono elencati nella Tabella 1. ceppi di E. coli e plasmidi utilizzati per lo studio Per Western blotting, dopo sodio dodecil solfato (SDS) elettroforesi su gel - polyacrylamide (PAG) con 12,5 gel di poliacrilammide, o la pagina le proteine ​​sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad) con un apparato blot semisecco (Schleicher Schuell). La proteina CAT è stata visualizzata con un siero specifico anti-CAT (Sigma Aldrich) con anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina come descritto in precedenza (20). La quantità relativa di CAT è stata stimata mediante densitometria. Preparazione di estratti cellulari grezzi e misurazioni spettrofotometriche di CAT attività biochimica sono state eseguite come descritto in precedenza (11). La concentrazione intracellulare di acetil-CoA è stata determinata spettrofotometricamente come descritto in precedenza (10). L'efficienza della sintesi proteica è stata stimata mediante misurazione del livello di incorporazione di precursori radioattivi in ​​materiale acido precipitable tricloroacetico come descritto in precedenza (18), ma 14 C-marcato aminoacidi (UVVVR) sono stati aggiunti a colture batteriche ad una concentrazione finale di 2,5 Ci / ml. E. coli CM2555 ha un difetto genetico che porta alla sua sensibilità cloramfenicolo in presenza di cat. Strain CM2555 è stato descritto come una delle serie di mutanti ILV dnaa (CM2555 porta l'allele dnaA508) altrimenti isogenico per la tensione CM732 (4). Tuttavia, utilizzando una serie di ceppi batterici e plasmidi (Tabella 1), abbiamo trovato che la sensibilità cloramfenicolo del ceppo CM2555 recante il gene cat non è causato dal allele dnaA508 o la combinazione di ilv e alleli dnaA508 (dati non mostrati). Quindi, possiamo concludere che ceppo CM2555 deve contenere un altro, precedentemente identificato mutazioni (s) che lo rende sensibile al cloramfenicolo, nonostante la presenza del gene cat. L'espressione di gene gatto nel ceppo CM2555. Densitometrica analisi di elettroferogrammi dopo SDS-PAGE e Western blot con siero anti-CAT ha rivelato che CM2555 / pBR328 produce almeno tre volte più CAT rispetto al ceppo parentale, CM732 / pBR328 (dati non riportati). Per verificare se un aumento del livello di CAT svolge un ruolo nei meccanismi della sensibilità cloramfenicolo di CM2555, abbiamo utilizzato plasmide pJKP1 che porta il gene gatto sotto il controllo di un promotore inducibile, p lac. insieme ad un altro plasmide, pJMH1, l'ospitare il q allele lacI. Aggiunta di isopropyl-- d - thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM portato a livelli CAT (sia CM2555 e host CM732) che corrisponde a circa il 90 di quello trovato in CM732 / pBR328 (dati non mostrati). Contrariamente ai risultati ottenuti in esperimenti di controllo, la maggiore efficienza di espressione cat correlata con la crescita più rapida del ceppo CM2555 / pJKP1 / pJMH1 in un mezzo cloramfenicolo contenente solo fino a concentrazioni IPTG di 0,1 mM, e un ulteriore aumento dell'efficienza di espressione cat portato alla inibizione della crescita batterica (Fig. 1). Pertanto, suggeriamo che l'efficienza di espressione del gene gatto può essere importante per la sensibilità cloramfenicolo del ceppo CM2555. Effetto della quantità intracellulare di CAT sulla crescita batterica in presenza di cloramfenicolo. E. coli CM732 e CM2555 ospitare pJKP1 e pJMH1 sono state coltivate in Luria-Bertani mezzo liquido. cat gene espressione dalla fusione - cat p lac è stata indotta una notte, e poi nel corso dell'espressione esperimento è stato mantenuto dalla presenza di varie quantità di IPTG. Cloramfenicolo inserito quando la densità ottica a 575 nm era 0,1. cicli di raddoppio sono stati determinati mediante il monitoraggio della crescita batterica (densità ottica a 575 nm) in presenza ed assenza di cloramfenicolo (34 g / ml). Simboli: cerchi aperti, CM732 / pJKP1 / pJMH1 coltivato senza cloramfenicolo circoli chiusi, CM732 / pJKP1 / pJMH1 coltivate in presenza di cloramfenicolo rettangoli aperti, CM2555 / pJKP1 / pJMH1 coltivato senza cloramfenicolo rettangoli chiuso, CM2555 / pJKP1 / pJMH1 coltivato in presenza di cloramfenicolo. Attività di proteine ​​CAT nel ceppo CM2555. Abbiamo misurato l'acetilazione di cloramfenicolo e calcolato che l'attività CAT totale per 1 mg di proteine ​​cellulari in ceppo CM2555 / pBR328 è stato superiore a quello in campioni analoghi preparati dal ceppo parentale, CM732 / pBR328 (unità di attività 1.20 gatto in CM2555 / pBR328 contro 0,73 unità di attività CAT in CM732 / pBR328). Inoltre, CAT rivela l'attività biologica sia CM2555 / pBR328 e CM732 / pBR328, come l'aggiunta di cloramfenicolo (fino a 34 g / ml) a colture di questi ceppi ha avuto effetti significativi sull'efficienza sintesi proteica (dati non mostrati). La sensibilità al cloramfenicolo del ceppo CM2555 esprimere risultati gatto dalla diminuzione dei livelli di acetil-CoA. Poiché CAT catalizza il trasferimento del gruppo acetile da acetil-CoA ad una molecola cloramfenicolo, abbiamo misurato i livelli di acetil-CoA nel ceppo CM2555 e deformazione CM732 cuscinetto pBR328 plasmide in assenza e presenza di cloramfenicolo. Abbiamo trovato che il livello residuo di acetil-CoA, senza l'aggiunta di antibiotico, era leggermente inferiore a CM2555 / pBR328 rispetto a quello in CM732 / pBR328 (il livello di acetil-CoA nel CM2555 / pBR328 era circa 90 di quello trovato in CM732 / pBR328). Tuttavia, dopo l'aggiunta di cloramfenicolo, il livello di acetil-CoA era approssimativamente costante in CM732 / pBR328, mentre è gradualmente diminuita in CM2555 / pBR328 (Fig.2 A e B). quantità intracellulare di acetil-CoA come influenzata da cloramfenicolo in E. coli CM732 / pBR328 (A) e CM2555 / pBR328 (B) e l'effetto di acetato di sodio sulla crescita batterica in presenza di cloramfenicolo (C). Negli esperimenti i cui risultati sono rappresentate in pannelli A e B, ceppi ospitano pBR328 sono state coltivate in Luria-Bertani mezzo liquido. Cloramfenicolo (34 g / ml) è stato aggiunto quando la densità ottica a 575 nm era 0,1 (tempo zero). I campioni sono stati prelevati ogni 5 min dopo l'aggiunta dell'antibiotico e sono stati poi analizzati per acetil-CoA. Per ogni ceppo, la quantità di acetil-CoA al tempo zero è stata presa come 1, e la relativa concentrazione è stata calcolata. Negli esperimenti i cui risultati sono rappresentate in pannello C, E. coli CM732 e CM2555 pBR328 ospitano sono state coltivate in Luria-Bertani mezzo liquido addizionato con diverse quantità di acetato di sodio. Cloramfenicolo inserito quando la densità ottica a 575 nm era 0,1. I cicli di raddoppio delle culture sono state determinate mediante il monitoraggio della crescita batterica (densità ottica a 575 nm) in presenza ed assenza di cloramfenicolo (34 g / ml). I valori riportati sono mezzi da tre esperimenti. In tutti i casi la deviazione standard era al di sotto 10. Simboli: cerchi aperti, CM732 / pBR328 coltivato senza cloramfenicolo chiuso cerchi, CM732 / pBR328 coltivate in presenza di cloramfenicolo rettangoli aperti, CM2555 / pBR328 coltivato senza cloramfenicolo rettangoli chiuso, CM2555 / pBR328 coltivato in la presenza di cloramfenicolo. Per verificare se una diminuzione del livello di acetil-CoA nel ceppo CM2555 / pBR328 è responsabile per la sensibilità di questo ceppo al cloramfenicolo, abbiamo misurato i tassi di crescita di colture batteriche in presenza di acetato di sodio. acetato di sodio può essere utilizzato come fonte alternativa di produzione di acetil-CoA in cellule (6). E 'stato riferito in precedenza (12), che il gatto esprimente il E. coli mutanti con mutazioni nel Acee o ACEF. che non può fare acetil-CoA dal piruvato, ma che può rendere acetil-CoA da acetato di sodio, sono resistenti al cloramfenicolo solo quando acetato di sodio viene fornito. Così, se l'ipotesi sopra indicato fosse vera, avremmo osservato un miglioramento della crescita di CM2555 / pBR328 in presenza di acetato di sodio. Infatti, abbiamo trovato che la presenza di acetato di sodio migliorato notevolmente la crescita di CM2555 / pBR328 nel mezzo contenente cloramfenicolo (Fig. 2 C). Abbiamo anche trovato che ceppo CM2555 potrebbe essere trasformato da diversi plasmidi recanti il ​​gene gatto quando selezione è stata eseguita su piastre contenenti sia cloramfenicolo (34 g / ml) e 0,15 di sodio acetato (dati non mostrati). Né i pBR328 numero della copia né la quantità di CAT in cellule CM2555 state influenzate dalla presenza di acetato di sodio in mezzo (dati non mostrati). Questi risultati sostengono fortemente l'ipotesi che diminuzione dei livelli di acetil-CoA nel gatto esprimente cellule CM2555 in presenza di cloramfenicolo risultato della sensibilità del batterio a questo antibiotico. RINGRAZIAMENTI Siamo molto grati a S. Baraska e A. Szalewska-Palasz per l'assistenza nella fase di esperimenti preliminari e di J. Davies per le discussioni e il supporto all'inizio di questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Comitato di Stato polacco per la ricerca scientifica (progetto 6 P04A 060 18). G. W. riconosce anche il supporto finanziario della Fondazione per la scienza polacca (sovvenzioni 14/2000). NOTE ricevuto 18 aprile 2001. restituito per la modifica 16 luglio 2001. Accepted 30 agosto 2001. autore corrispondente. Indirizzo postale: Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di Danzica, Kadki 24, 80-822 Gdask, Polonia. Telefono: 48 (58) 346 3014. Fax: 48 (58) 301 0072. E-mail: wegrzyn biotech. univ. gda. pl. RIFERIMENTI Bolivar F. Backman K. (1979) I plasmidi di Escherichia coli come vettori di clonazione. Metodi Enzymol. 68. 245 257.Chang C. Y. Cohen S. N. (1978) Costruzione e caratterizzazione di amplificabile multicopia veicoli clonazione DNA derivati ​​dalla p15A miniplasmid criptico. J. Bacteriol. 134. 1141 1156.Davies J. (1994) inattivazione di antibiotici e la diffusione di geni di resistenza. Scienza 264. 375 382.Hansen F. G. von Meyenburg K. (1979) Caratterizzazione del dnaa. gyrB. e altri geni nella regione dnaa del cromosoma coli Escherichia sulla trasduzione fagi specializzati lambdacia - TNA. Mol. Gen. Genet. 175. 135 144.Jensen K. F. (1993) I Escherichia coli tipi selvatici W3110 e MG1655 hanno telaio rph spostamento mutazione che porta alla pirimidina la fame a causa di bassi livelli di espressione pira. J. Bacteriol. 175. 3401 3407.Jones-Mortimer M. C. Kornberg H. L. (1977) L'interconversione enzimatica di acetato e acetil-coenzima A in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 102. 327 336.Kedzierska S. Staniszewska M. Potrykus J. Wegrzyn G. (1999) Gli effetti di alcuni plasmidi di resistenza agli antibiotici, che attribuisce alla rimozione delle proteine ​​di calore aggregati da Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 176. 279 284.Lewendon A. Shaw W. V. stabilizzazione dello stato (1993) Transizione da cloramfenicolo acetiltransferasi. J. Biol. Chem. 268. 20997 21001.Nikaido H. (1994) Prevenzione di accesso farmaco a target batterici: barriere di permeabilità e efflusso attivo. Scienza 264. 382 388.Pr B. M. Wolfe A. J. (1994), il regolamento della sintesi acetil fosfato e degrado, e il controllo di espressione flagellare in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 12. 973 984.Shaw W. V. (1975) cloramfenicolo acetiltransferasi dai batteri cloramfenicolo resistenti. Metodi Enzymol. 43. 737 755.Shaw W. V. (1983) cloramfenicolo acetiltransferasi: enzimologia e biologia molecolare. Crit. Rev. Biochem. 14. 1 46.Shaw W. V. Packman L. C. Burleigh B. D. Dell A. Morris H. R. Hartley B. S. (1979) struttura primaria di una acetiltransferasi cloramfenicolo specificato da plasmidi R. Natura 282. 870 872.Silhavy T. J. Berman M. L. Enquist L. W. (1984) Esperimenti con fusioni geniche. (Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY).Singer M. Baker TA Schnitzler G. Deischel SM Goel M. Colomba W. Jaacks KJ Grossman dC Erickson JW lordo CA (1989) Una collezione di ceppi contenenti antibiotico alternato geneticamente collegato resistenze per la mappatura genetica di Escherichia coli. Microbiol. Rev. 53. 1 24.Vester B. Garret R. A. (1988) L'importanza di nucleotidi altamente conservati nella regione di legame di cloramfenicolo al centro trasferimento peptidyl di Escherichia coli 23S RNA ribosomiale. EMBO J. 7. 3577 3587.Vieira J. Messing J. (1988) I plasmidi PUC, un sistema M13mp7-derivato per mutagenesi inserzionale e la sequenza con primer universali sintetici. Gene 19. 259 268.Wegrzyn G. Kwasnik E. Taylor K. (1991) replica del plasmide in amino ceppi di Escherichia coli acido-fame. Acta Biochim. Pol. 38. 181 186.Wegrzyn G. Glass R. E. Thomas M. S. (1992) Coinvolgimento del Escherichia coli RNA polimerasi subunità nell'attivazione trascrizionale dall'IC batteriofago e proteine ​​CII. Gene 122. 1 7.Wegrzyn A. Wegrzyn G. Taylor K. (1995) Protezione di proteine ​​iniziatore colifago O dalla proteolisi nel montaggio del complesso replica in vivo. Virologia 207. 179 184.Wegrzyn G. Wegrzyn A. Pankiewicz A. Taylor K. (1996) allele specificità della funzione del gene Escherichia coli dnaa nella replicazione di plasmidi derivati ​​da fago. Mol. Gen. Genet. 252. 580 586.Zaidenzaig Y. Fitton J. E. Packman L. C. Shaw W. V. (1979) Caratterizzazione e confronto di varianti cloramfenicolo acetiltransferasi. Euro. J. Biochem. 100. 609 618.Zgurskaya H. I. Nikaido H. (2000) meccanismi di multidrug resistance: efflusso di droga attraverso due membrane. Mol. Microbiol. 37. 219 225.Copyright 2001 American Society for Microbiology